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科研进展

逆境中心利用CRISPR/Cpf1系统简单高效实现水稻多基因定点编辑

2017-03-20

 

     3月18日,Molecular Plant杂志在线发表了中国科学院上海生命科学研究院植物逆境生物学研究中心朱健康课题组题为“Multiplex Gene Editing in Rice using the CRISPR-Cpf1 System”的研究论文。该工作在水稻中利用CRISPR/Cpf1系统实现多基因位点编辑,效率达到40-75%;同时该系统在载体构建上比CRISPR/Cas9系统更加简单易行。该工作为水稻多基因定点编辑提供了一个简单高效的新工具。
 
    CRISPR/Cas9系统在基因定点编辑方面已经得到了大量的应用,然而CRISPR/Cas9系统依然存在着一定的局限性。在CRISPR/Cas9系统中,需要CRISPR转录形成RNACRISPR RNA (CrRNA)与反式作用型CrRNA(trans-activating crRNA, tracrRNA)两种小RNA分子,两种RNA分子部分区域配对形成复合体。随后,该复合体引导具有非特异核酸酶活性的Cas蛋白切割与crRNA匹配的DNA序列。因此,工程化的CRISPR/Cas9系统也需要将CrRNA与tracrRNA融合在一起形成单一的chimeric RNA(chiRNA),并且需要在宿主RNA酶的帮助下才能发挥作用。同时,利用该系统进行单次多基因定点编辑时,载体系统构建复杂,每一个定点编辑位点均需要单独的启动子和终止系列。
 
    近年来,科学家发现并改造出Cpf1 (CRISPR from Prevotella and Francisella 1)系统,研究表明该系统能克服CRISPR/Cas9的上述局限,它不需要tracrRNA的辅助,并且Cpf1蛋白兼具DNA剪切酶和RNA修剪酶的功能,不但能靶向切割DNA双链,而且能把相应的非成熟型CrRNA(pre-crRNA)加工剪切成成熟型CrRNA。
 
    逆境中心朱健康研究组利用Francisella novicida Cpf1 (FnCpf1)和 Lachnospiraceae bacterium ND2006 Cpf1 (LbCpf1)对水稻进行单位点和多位点基因敲除的测试,研究表明上述两个Cpf1只需一条非常短的20-21bp的直接重复序列(direct repeats, DR)加上22-24bp的靶位点识别序列(guide)即可实现单基因敲除,更重要的是,把多个DR-guide单元直接串联,只需要一个启动子驱动即可简单高效地实现多基因敲除。该研究利用4个DR-guide单元组成的CrRNA短阵列分别对水稻RLK和CYP81A家族的四个基因进行编辑,各位点的敲除效率达到40-75%。该系统简单、高效地在水稻中实现了多基因定点编辑,拓展了CRISPR系统在植物中的应用,为水稻基因组定点编辑提供了一个新利器。
 
    该工作得到了中国科学院的经费支持。
 
T-DNA constructs of FnCpf1 and LbCpf1 for multiplex gene editing in rice and the resulting mutagenesis efficiency in rice