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科研进展

植物逆境中心Daisuke Miki课题组和朱健康课题组通过all-in-one策略及TMV Ω翻译增强子序列实现基因精确敲入

2019-09-29

        2019年9月25日,Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了来自中科院上海植物逆境中心Daisuke Miki课题组和朱健康课题组合作的题为“Gene targeting in Arabidopsis via an all-in-one strategy that uses a translational enhancer to aid Cas9 expression”的研究论文。该研究在原来的基础上,实现了一步到位(all-in-one)的基因打靶方法。
 
        在该研究中,将Cas9蛋白、gRNA和HR修复供体序列一次性全部设计在同一个载体上进行一次转化(如下图所示)。此外,该研究还增加源于TMV的Ω翻译增强子序列以增强Cas9蛋白的表达,在HR供体序列两侧增加sgRNA识别位点及使用具有EC1.1启动子的嵌合EC1.2 / DD45增强子来驱动Cas9表达。

        该研究发现,在不使用增强子等元件的条件下,基因敲入的效率只有0.68%。而通过利用源于TMV的Ω翻译增强子序列增强Cas9蛋白的表达,在DD45启动子的驱动下,能将基因敲入的效率提高3倍,达到2.4%。此外,研究发现,EC1.2/DD45的增强子配合EC1.1启动Cas9蛋白的表达,在该体系中并没有效果。在HR供体序列两侧增加sgRNA识别位点,也不能增加基因敲入的效率。

        该研究表明,尽管使用all-in-one策略进行基因打靶的效率低于两步法的效率,但是在未来的工作中,将进一步优化all-in-one策略,提高基因打靶的效率,使其能更高效地应用于拟南芥的任一生态型或者基因组背景植株,或其他能使用浸花法转化的高等植物。
 
        本研究得到了中国科学院的资助。硕士研究生彭方楠和张文心为论文的第一作者,Daisuke Miki研究员和朱健康研究员为论文的通讯作者。